2000年，季莫申科与总统库奇马的关系逐渐恶化，重新卷入拉扎连科丑闻。2000年8月，季莫申科的丈夫因为向前总理拉扎连科行贿被捕入狱。2001年1月15日，乌克兰国家总检察院以走私和偷税漏税罪名对她正式提出指控，称季莫申科涉嫌从1997年到1999年，私吞公款11亿美元，偷税漏税15万美元。1月19日，库奇马总统签署命令解除了她的职务。2月13日，季莫申科被警方正式逮捕。
乌总检察院逮捕季莫申科后，又对她提出了新的指控：警方怀疑她在“统一能源系统公司”任职期间，曾向拉扎连科行贿7900万美元。据调查，季莫申科在任乌克兰“统一能源系统公司”总裁期间，曾与政府官员勾结，从俄罗斯走私天然气达30亿立方米，获利达4.45亿格里夫纳（约合8000万美元）。在走私天然气过程中，她使用了伪造的文件并利用犯罪团伙达到目的。同时，俄罗斯军事检察总院也怀疑季莫申科与俄国防部军事财政和预算总局局长奥列尼科将军渎职案件有牵连。他们两人在任职期间，曾促成俄国防部与乌“统一能源系统公司”签署了一项价值为4.5亿美元的电力供应合同，双方均从合同中获得一笔不菲的收入。奥列尼科将军已被俄警方逮捕，俄罗斯当时就希望能提审季莫申科。2001年4月2日，乌克兰最高法院裁定，基辅佩切尔区法院2001年3月27日关于释放乌克兰前副总理季莫申科的判决有效，暂停实施基辅市法院2001年3月30日关于再次逮捕季莫申科的决定。乌最高法院院长博伊科当天审议了季莫申科的律师的上诉，并裁定基辅市法院在审议该案件时没有遵循乌刑事诉讼法的司法监督程序。
2005年1月26日，俄总检察长乌斯季诺夫表示，尽管尤利娅·季莫申科已被任命为乌克兰临时总理，但俄方对她的刑事犯罪调查并未取消。因此，这位“铁娘子”仍是俄全球通缉的嫌犯，她的名字仍被列在国际刑警组织全球通缉的黑名单上。因行贿被俄方立案。俄军事检察院总检察长萨文科夫称：“根据俄刑法第291条，季莫申科被指控犯有行贿罪。”1996年，季莫申科担任“乌克兰统一能源公司”总裁期间，曾向俄国防部的5名军官行贿，使俄国防部以高出实际价格的收购价从该公司进口了约8000万美元的产品。
乌克兰总统尤先科8日突然下令解散由美女总理季莫申科领导的政府，任命第聂伯罗彼得罗夫斯克州州长尤里·叶哈努罗夫为代总理。消息传出后，舆论开始纷纷揣测尤先科“拿下”季莫申科的真正原因。不过，早在季莫申科被撤职的消息传出之前，就已经有人预测季莫申科的总理位子肯定坐不长了，其中就包括乌总统编外顾问、俄右翼力量联盟领导人之一涅姆佐夫9月8日所说的一番话。
涅姆佐夫8日暗示说，“尤先科·季莫申科”这套在天鹅绒革命期间打造的双轮马车已很难再走下去。涅姆佐夫说，乌克兰国内目前的政治危机主要是是由总统尤先科与总理季莫申科的意识形态冲突造成的。尤先科坚持乌克兰走建立在民主与自由基础上的欧洲发展道路，而季莫申科则主张以“家长作风”和“民粹主义”走出一条特殊的道来。
“除政治危机外，乌克兰目前还陷入了谁也不曾料到的经济危机，这主要表现在工业生产从13%下降到了2.5%。不仅如此，在丰收之后，乌克兰还出现了少见的通货膨胀，燃料、肉类和面包的价格上涨。经济投资急剧减少，资金大量外流，等等”，涅姆佐夫说，“所有这些都是由季莫申科政府外行造成的。”
涅姆佐夫指出，“我对季莫申科的主要批评是她制造了乌克兰的不良投资环境，对此，乌克兰却没有人愿意说，尤先科的立场是明晰且正确，她不但不听，而且所有人都对着干，我不敢设想如果普京给弗拉德科夫（俄总理）下达指示，而弗拉德科夫不但什么都不做反而对着干会是什么样子。”
乌克兰前总理季莫申科的新闻发言人索罗卡2010年5月11日说，乌总检察院已传唤季莫申科接受刑事案件调查。索罗卡说，季莫申科被要求于当地时间12日上午10时前往总检察院调查局。她表示，季莫申科可能会遭到刑事调查和被限制人身活动自由。据乌克兰总检察院新闻处透露的消息，检察官将向季莫申科递交关于限制人身活动自由的决定，要求她配合一起刑事案件调查。
乌政府主管政法工作的副总理西夫科维奇2010年5月11日对媒体说，季莫申科政府滥用国家财政支出款项超过1000亿格里夫纳（1美元约合7.92格里夫纳），其中150亿格里夫纳涉嫌贪污。他预计，对季莫申科政府在财政领域滥用职权的调查将在2010年秋天之前完成。季莫申科当天参加了反对派在议会大厦附近举行的抗议活动。她呼吁支持者们向当局施压，要求废除乌克兰与俄罗斯签署的关于延长俄黑海舰队在乌境内驻扎期限的协议。
2011年5月24日，乌克兰检察官正式起诉前总理尤利娅·季莫申科，指控她滥用职权，签署高价进口俄罗斯天然气的协议。乌克兰前总理季莫申科当天在该国总检察长办公室接受了调查人员问询，幸亏有律师随行，否则这位知名的美女政要很有可能会被乌克兰检方以阻挠滥用权力调查为名，将其逮捕。
季莫申科所领导的全乌克兰“祖国”联盟党24日在其网站上宣称，总检察长的办公室当天被数十名蒙面警员把守。季莫申科在接受完问询后，因涉嫌滥用职权遭到逮捕。不过，乌克兰检方随后否认了这一消息。
乌克兰总检察长办公室称，尽管法院已经发布命令允许在必要时候随时逮捕季莫申科，不过24日在问询结束后，调查人员还是允许她离开。“调查人员本可以将她拘留，但是由于她带着律师一同前来接受问询，因此调查人员便遵循有关程序，未将其拘留，”乌克兰总检察长办公室的一名发言人说。
乌克兰检方在一份声明中指出，被控滥用权力出售温室气体排放权及购入紧急救援车辆的季莫申科，“长期以来一直在试图回避审前调查，并且设法阻挠对其进行的调查。”
依照2009年1月签订的协议，乌克兰以每1000立方米450美元的价格从俄罗斯进口天然气，高于许多欧洲国家进口俄天然气的价格。
乌克兰总检察长办公室发言人尤里·博伊琴科说，这份10年期协议令乌克兰蒙受35亿格里夫纳（约合4.4亿美元）损失，季莫申科签署协议时未获内阁批准。乌克兰先前多次因天然气价格与俄罗斯发生纠纷，俄方一度暂停向乌方供气。由于俄罗斯供应其他欧洲国家的天然气大多经乌克兰输送，俄方“停气”引发多国天然气短缺，持续数周。
但是季莫申科却否认了检方的指控，辩称这份合同帮助结束乌俄天然气问题纠纷，自己并无过错。
除了这项指控外，季莫申科还受乌克兰检方两项涉及腐败的指控。其一是挪用5.26亿美元环保基金，用于支付养老金；另一项是把斥资数百万美元购买的救护车用于私人活动。
对此，季莫申科坚称自己清白，称这些控告是总统维克多·亚努科维奇打击反对派的手段。
2011年10月11日，季莫申科在基辅佩切尔斯基区地方法院就签订乌俄天然气合同时滥用职权指称接受法院初步宣判。法官罗季翁·基列耶夫随后宣读了法院判决书，指季莫申科2009年时初与俄罗斯签订天然气进口协议时滥用职权，违反司法程序，亲自批准签订协议，致使乌克兰进口俄产天然气价格高于许多欧洲国家，对国家造成了15亿格里夫纳（约合1.9亿美元）的经济损失。由此，季莫申科有罪判决基本成立。
据报道，季莫申科数次出庭的表现都让法官不满，最终法官认为其藐视公堂而下令当庭羁押她。
主审法官洛蒂昂·吉里耶夫表示，从庭审至今，季莫申科的表现一直很出格，“她多次试图妨碍诉讼过程而避免遭到审判。”
在庭审中，季莫申科“公开侮辱”了一名法官，当场被驱逐，而且她所在的反对党“祖国”联盟的一名议员与警察在庭上发生冲突，导致庭上一度秩序混乱。甚至在庭审期间，她在回答法官提问时，没按照规定起立，其支持者也多次插话打断庭审。
法官吉里耶夫对季莫申科的态度十分恼火，最终下令将其拘捕。消息说，此前，季莫申科自从被指控以来，警方只要求她不离开首都基辅，并未拘捕她。被拘捕后，戴着手铐的季莫申科被带出法庭，她的支持者高呼“耻辱”，大声指责法官和检方。
法院认为，季莫申科作为被告涉嫌扰乱法庭秩序、嘲笑法官、妨碍证人发言、故意拖延案件审理进程，有逃避调查嫌疑。控方还发现她在接受审判时，仍使用iPad在其“推特”上留言。
报道介绍说，如果季莫申科此次被判有罪，她将面临7至10年的牢狱生活。但即使这次她能躲过牢狱之灾，陪审团任何一条有罪裁定也会导致她失去明年议会选举和下届总统大选的资格。
而自司法当局宣布羁押季莫申科后，首都基辅的气氛变得紧张。不久后，季莫申科的百余名支持者百在基辅市中心静坐示威，抗议司法当局的决定。这200余人完全不顾禁令，继续在法院附近地带的静坐活动。上百名警察围守在周围，维护秩序。
乌克兰法院已宣布禁止在法院周围、以及当年作为橙色革命活动中心的广场上组织任何声援季莫申科的集会活动。
被指“迫害”季莫申科的乌克兰总统亚努科维奇11日时则通过总统办公室发表声明称，不会就季莫申科遭法院判处当庭羁押一事做出干预，他表示，自己不能、也不打算介入司法事务。他说，如果自己介入，“问题将更大”。
声明援引亚努科维奇的话说，乌克兰司法体系是独立的，不存在偏见，也只能受到乌克兰宪法和法律的指导。政治上或任何形式的干预都是不可接受的。
报道指出，这是季莫申科上周遭羁押至今，亚努科维奇首次公开发表对此事的立场。
而在此时，乌克兰检察官对季莫申科审判和拘押的决定更是引起了西方国家的强烈反响。美国方面呼吁乌克兰当局立即放人，认为羁押季莫申科的决定使得相关司法程序显得有“政治目的”。
法国政府5日则称对季莫申科被捕感到“非常忧虑”，并表示将密切关注该案进展。法国外交部发言人克里斯蒂娜·法热当晚发表声明说，法国对乌克兰司法机关审判季莫申科的动机存在疑虑。此外，法方还认为，被告方的权利在审判中没有得到保障。
随后法国外交部声明强调，法国、欧盟与乌克兰的合作关系建立在尊重法律的基础上，法国与其它欧盟伙伴国家将继续密切关注季莫申科案的进展。
而且，法国还传召乌克兰驻法国大使，就季莫申科遭法庭裁决羁押一事进行紧急磋商。
法国外交部一名女性发言人说，因法国对乌克兰前女总理季莫申科被收押一事表示“严重关切”，已传召乌克兰驻巴黎大使，就此事进行问讯和磋商。该发言人称，法国将密切关注事态的发展。
此前，欧盟和美国都曾表示，如果在对季莫申科调查期间存在“违反民主和司法公正证据”的行为，有可能对乌克兰实施制裁。
乌克兰前总理季莫申科遭受不公正对待为由抵制欧洲杯的呼声，该国现任总理阿扎罗夫警告说，德国在季莫申科事件上切勿带有偏见，并明确指出季莫申科“狱中被殴”的指责不成立。
季莫申科患有严重椎间盘突出，却不信任由政府安排的本国医生，希望能于监外得到外国医生的治疗。不仅这一愿望没有得到满足，季莫申科甚至声称遭到狱中看守的殴打。作为证据，其女儿在互联网公布的照片显示季莫申科的胳膊上有淤血伤痕。但乌克兰检方却暗示，这些伤痕很可能是季莫申科为引起国际注意而自己所为。之前基辅的一些独立媒体也对季莫申科的控诉持怀疑态度，但遭到季莫申科家人的严词驳斥。
季莫申科两周来绝食抗议监狱不公对待，由于其身体状况逐渐恶化，乌克兰政府表示不排除对其进行强制进食。
基于季莫申科的申诉，德国政府高官率先表示，在季莫申科狱中状况得不到改善的情况下，政府官员将拒绝前往乌克兰观看欧洲杯足球赛，并呼吁抵制欧洲杯在乌克兰举行，目前这一呼吁已得到不少欧盟国家的响应。
德国医生爱因豪珀尔在会见季莫申科后对媒体表示，季莫申科已同意在乌克兰接受治疗，将于下周被送往查科夫的铁路医院，在那里接受由德国和乌克兰医生组成的医疗队的治疗。
而乌克兰前总理季莫申科遭受不公正对待为由抵制欧洲杯的呼声，该国现任总理阿扎罗夫警告说，德国在季莫申科事件上切勿带有偏见，并明确指出季莫申科“狱中被殴”的指责不成立。
