1.拍摄前注意设定好相机的参数数码相机在设置菜单中提供多种设定值。包括图像分辨率、聚焦方式、光圈、快门等项目，其中最常用的是图像分辨率。许多相机都提供了多种分辨率选择，多数相机都有一个缺省的设置，如果有一段时间未使用相机，重新开机时，缺省设置会自动生效。因此，每次拍摄之前，特别是更换电池之后，必须重新检查一次相机的设置菜单，确认分辨率、光圈等的设置，否则，照片质量达不到预期的效果。
2.CCD 分辨率和像素数码相机采用电荷耦合器件CCD 作为感光部件，CCD 分辨率是评价数码相机优劣的重要指标，现在数码相机一般都可以达到1600×1200的水平，甚至更高。一般来讲总像素水平达到300万左右就可以满足大多数病理拍摄，更高像素数码相机可以得到更高质量的照片，但同时也增加了图像文件的体积。
3.取景器和液晶显示器大部分数码相机在配有光学取景器的同时还配有液晶LCD 显示器作为取景器，这样不仅可以通过LCD 来构图，也可以通过它来显示刚刚拍摄的照片效果，以决定是否达到了预期目的，来判断要不要重新拍摄。在应用目镜显微拍摄观察中，镜头与目镜重叠，取景器看不到拍摄的图像，因此，必须用LCD 来取景。采用LCD 对焦时，由于LCD 像素有限，往往效果不佳，此时，可以用连线将相机与计算机连接，在计算机屏幕上进行对焦，可以得到非常清晰的图像。
4.镜头变焦功能与视角变化数码相机一般都具有变焦功能，可以让相机焦距在一定的范围内任意选择，不同焦距下相机视角也不一样，长焦距下视角窄，而短焦距下视角宽阔。对病理拍摄而言，相机的近摄功能非常重要，一定程度上讲比远摄更重要，因此，在购买时一定要注意数码相机的微距拍摄功能。
5.色深色深就是数码相机对颜色的表现能力。市售的数码相机大多数是24位色深。24位就是每一种颜色用8位存储，一种颜色可以有256个色阶，三色配合就可以显示256×256×256共计16777216种色彩，这些色彩对大多数病理应用来讲已经完全够用了。
6.光照条件在良好的光照条件下，大多数数码相机可以拍摄出效果良好的照片，因此，在拍照之前，一定要找到尽可能好的光照条件。在数码相机照片范围内光照太强的话，就会产生带状效果，同时，由于CCD 有一定的感光阈值，如果光线较暗，达不到要求的起码照度，能明显地降低照片的清晰度，如在数码相机拍摄荧光显微镜、荧光电泳等荧光图像时，效果很差，采用更灵敏的CCD 感光部件是改善数码相机低光照条件下拍摄效果的最有效途径。
用数码相机拍摄大体标本或体表病变，自然光是最好的，利用灯光和相机闪光灯也可以，但是需要控制灯光，使其成为直射光。用数码相机进行显微图像拍摄时，应使用强制不闪光。
7白平衡及色温调节彩色胶卷有日光型和灯光型之分，目的是适用于不同的光源环境，日光色温室5000K 的，卤素石英灯色温是3200K。数码相机无法更换胶卷，所以采用白平衡调节。数码相机的白平衡有手动和自动之分。自动白平衡是根据自然条件下日光现场环境光来自动调整校正白平衡，可以保证自然光条件拍摄效果不会偏差很大。显微摄影的光源是灯光，如用自动白平衡拍摄，图像会出现偏蓝色，因此，数码显微照相时应选择手动白平衡，先将切片有盖玻片的空白区设为白色，再进行拍摄。但不同的数码相机拍摄的差异很大，所以对于白平衡的调节，必须针对不同的显微镜和不同的数码相机，自己试验，摸索出适合自己的白平衡条件。
8.处理时间数码相机在拍摄完一张相片后，相机需要进行一系列的内部处理，如生成图像、进行压缩、存储图像、CCD 清除电荷、重新设置等，虽然这个时间很短，有两三秒钟，但对一些需要捕捉实验过程的拍摄，可能造成不便，不过随着数码相机技术的发展，该缺点将会解决。
9.记忆卡容量和压缩技术数码相机拍摄照片都存储在存储卡中。储存卡有多种类型，常用的有：CF 卡、SD 卡、记忆棒等。存储照片数量和存储卡容量有直接关系，容量有64M、128M、256M、512M 等规格，目前，有容量巨大的数码相机伴侣，容量可达数十兆。数码相机可以提供几种不同的拍摄模式和存储模式。拍摄模式可以有高、中、低不同档次。不同相机采用不同的压缩技术，就有不同的图像格式，常用的图像格式有JPEG、TIFF、GIF 等。图像压缩都是有损压缩，压缩比大则图像信息损失大。在拍摄过程中，可以根据需要，选择不同的拍摄模式，拍摄照片数目和照片用途。高质量下拍摄照片所占用容量大，这样可存储的相片就少；相反，低质量条件下则可以存储较多的相片。
10.数码相机接口数码相机拍摄照片可以和打印机直接相连并打印的数码相机，但大多数数码相机拍摄照片要通过计算机来显示、处理、存储和输出。数码相机与电脑连接目前多使用USB 接口，传输速度更快的IEEE1394接口在部分数码相机已有应用。
11图像后期处理用图像处理软件可以改善图像质量，如修正光照缺陷、裁剪、去斑降噪、符合文字标记等。常用的图像处理软件包有Photoshop、UleadImpact、Photo－Deluxe等。
12.数码照片的输出
（1）数码冲印：数码冲印在大中城市已经比较普及，价格也被大家接受，而且冲印质量好，因此，数码冲印是今后数码相片输出的主要方式。
（2）数码打印：就打印机而言，热升华打印机效果最佳，但费用也最高，一般病理科很少配备。照片级彩色喷墨打印机的输出质量也非常好，打印纸首选照片质量光泽纸和照片纸，同样打印费用也相对较高。打印质量越高，打印时间越长，耗墨量越多。如果要打印出一张高质量的照片，可以将喷墨打印的照片进行冷裱，冷裱膜选用中间偏细的型号，做出来的照片与冲洗的照片区别不大。
13.数码相机电源数码相机都使用普通AA 型、LR6型或UM3型电池供电，这样对于数码相机耗电量也要有所考虑，特别是在使用LCD 时，耗电量激增。不过，现在的数码相机对耗电量控制得都不错，使用4节碱性电池或镍氢电池都可以满足一次全容量拍摄，但建议在室内拍摄时应用稳压直流外接电源，在户外拍摄时，要带好已充满电的备用电池，并使用节电模式。
流式细胞分析（FCM）技术
一、概述
1.流式细胞分析技术是采用流式细胞仪（FCM）对细胞悬液进行快速分析，通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。FCM 综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学以及激光及计算机等多门学科和技术，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、方法灵活、分析全面等特点，还有对所需细胞进行分选等特殊功能。随着流式细胞技术水平的不断提高，其应用范围也日益广泛。流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域，并从研究室逐步进入临床实验室，成为常规实验诊断的重要手段，不仅为临床提供了重要的诊断依据，也使检验科室的诊断水平、实验技术达到一个新的高度。流式细胞分析（FCM）技术是诊断病理学的一项重要辅助诊断技术，一般用于组织病理学初步诊断后的进一步分析，应用日益广泛。
流式细胞分析技术主要用于肿瘤细胞的免疫表型分析、DNA 含量分析、非二倍体细胞定量分析、细胞增殖和凋亡分析等。
2.制备合格的检测样本是流式细胞分析技术的关键。
3.对样本进行荧光染色或免疫荧光染色流式细胞分析技术检测时，必须同时设立阴性对照、阳性对照或自发荧光对照。
4.流式细胞分析技术在淋巴造血组织肿瘤等的病理学诊断中正在成为评估预后和指导治疗的指标，有时可作为独立的病理学诊断报告项目。
5.流式细胞分析报告的内容为由流式细胞仪打印的原始检测结果。作为病理学诊断报告书组成部分的流式细胞分析报告须经有关病理医师审核后签发，必要时可由病理医师对检测结果作出评论。
二、单细胞悬液的制备
（一）新鲜实体瘤单细胞悬液的制备
1.酶消化法
（1）选取的组织立即放入预冷的组织培养液或生理盐水中，清洗血迹及其他污染物。
（2）解剖显微镜下弃除组织块中的坏死成分、纤维、脂肪以及血管等。
（3）用弯剪将组织剪成约1.0mm3的小块，放在冷组织培养液或生理盐水中。
（4）用冷培养液或生理盐水漂洗剪碎的组织块，洗去被剪碎的细胞碎片。
（5）取约1.0g组织加入适宜的酶消化液。
（6）在37℃的恒温水浴中消化20～30分钟，消化期间要间断振荡或吹打。
（7）用冷培养液或生理盐水终止消化，收集单细胞悬液。
（8）先后用200目的筛网和350目的尼龙网过滤除去凝聚的细胞团块，收集细胞并计数，总量不少于106个。根据检测目的作进一步测试。如做DNA 含量分析，须将细胞悬液用70％冰冷乙醇固定，置4℃冰箱保存；如做免疫荧光分析，则不必用乙醇固定。
2.机械法
（1）剪碎法
①将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水或0.01mo1／L（pH7.4）的PBS液。
②用剪刀将组织剪至匀浆状。
③加入0.01mo1／L 的PBS10ml。
④用吸管吸取组织匀浆，先以200目的筛网过滤至试管内。
⑤离心沉淀（1500rpm，3～5分钟），再用PBS 液洗3次，每次离心（500～800rpm，5～8分钟），除去细胞碎片。
⑥以350目的尼龙网过滤，除去凝聚的细胞团块。
（2）网搓法
①将100目的尼龙网扎在小烧杯上（为减少污染，可将小烧杯固定在试管架上）。
②将剪碎的组织放在网上，以眼科镊子或刮刀轻搓组织块，边搓边以盐水冲洗，直至将组织搓完。
③收集细胞悬液：500～800rpm 离心沉淀5～8分钟，然后倾弃细胞碎片，做细胞计数（应不少于106个）。
（3）研磨法
①先将组织剪碎至小块。
②将组织块放入组织研磨器中，加入1～2ml生理盐水。
③转动研棒，制备匀浆。
④加入生理盐水10～20ml，冲洗研磨器，收集细胞悬液，并经350目尼龙网过滤，离心（500～800rpm），沉淀5～8分钟。
3.化学法（EDTA 螯合法）
（1）将组织切成小块放入试管中。
（2）先加入EDTA 液5ml，室温下30分钟，然后弃去EDTA 液。
（3）再加入EDTA 胰酶5～10ml，取10ml，在37℃恒温水浴中作用30分钟，其间间断振荡3～5次。
（4）用350目尼龙网过滤，离心沉淀（1000rpm）5分钟；再以生理盐水洗2～3次，离心（800rpm）5～8分钟。
（5）收集细胞悬液再离心一次，然后弃去上清液，将管底的细胞吹打均匀后吸入细颈吸管内，总体积约0.1～0.2ml；将其用力吹入70％的预冷乙醇中并不断振荡，避免细胞结成团块。在样本固定后置4℃冰箱中待检。上述酶消化法、机械法和化学法可单一选用或联用。
4.低渗液处理法
（1）选取新鲜肿瘤组织0.5g，剪成1.0mm 左右的组织块，置于10ml试管中。
（2）加入Tris缓冲液5ml，离心洗涤一次。
（3）加入染液-去污剂溶液5～10ml，置于4℃冰箱中12～24小时。
（4）用350目的尼龙网过滤去除细胞团块及组织块，离心（1500rpm）沉淀5～8分钟，获得细胞核悬液。
（5）用标准染液进行DNA 染色，上机检测。
（6）如保存样本，须将其固定于70％乙醇中，然后置于4℃冰箱中备检。
（二）新鲜实体瘤单细胞脱核悬液的制备
适用于细胞核内成分的分析，特别是用于DNA 定量和细胞周期测定。
1.快速核分离和染色程序的一步法
（1）配制细胞核分离-染色液
Ca2＋（1mmolCaCl2）NP－40（0.6％）
Mg2＋（0.5mmolMgSO4）BSA（2％）
磷酸等渗盐缓冲液PBS（0.01mmol，pH7.2）1000ml（2）荧光染料的配制①碘化丙啶（propidiumiodide，PI）溶液：碘化丙啶5mg，RNA 酶2mg，TritonX－1001.0％（或NP－400.5ml），生理盐水65ml，枸橼酸钠100mg，加蒸馏水至100ml，调pH 为7.2～7.6，置于4℃冰箱避光保存备用。
②溴化乙啶（ethidiumbromide，EB）溶液：配制方法同PI，但浓度为PI用量的1／5，即100ml染色液中仅含1mg的EB。
（3）核分离和染色程序
①按前述新鲜实体瘤单细胞悬液的制备方法获得样本。
②放入分离液-染色液3～5ml，室温下保持3分钟。
③用200目的尼龙网过滤，除去组织碎片，20％冷乙醇固定。
④将细胞悬液固定液离心后弃去，PBS 缓冲液洗1次或2次。
⑤加入PI染液1.5ml，进行DNA 染色（至少30分钟），上机待检。样品也可保存在4℃冰箱中。
