（四）图像分析技术应用中要注意的一些问题
1.随机性的问题为了确保图像分析结果的客观性，组织取材、图像取景都必须有随机性，这样的结果才具有客观性。因此，无论是常规工作还是科研工作，在尽量小的工作量内，取材、取景都要按规定进行。
2.标准化的问题在整个病理取材、制片过程中，图像分析过程中涉及的脱水、埋包、固定、染色时间、温度等均可影响分析结果，特别是在做灰度、颜色等分析时，所以要求整个过程必须标准化。
3.参数选择的问题无论是常规还是科研设计，分析参数的选择都至关重要，其原则是选择能充分反映病变特征结构、形态变化参数的前提下，参数越少越好，这样能在充分反映病理改变的基础上，尽量减少工作量。
4.结果的分析判断图像分析结果不能单独作为诊断依据，必须与相应的组织学切片观察相结合。
二、病理照相技术
（一）概述
病理学是一门形态学学科，客观、准确地记录病理图像对病理诊断、教学和科研都有比较重要的价值。病理学照相客体包括：
①大体照相（患者体表病变、手术切除标本、尸检标本和动物实验标本）；②显微图像（各种染色的组织切片）；③文字图像资料翻拍（各种文字资料、实物、X 线片）；④电子显微镜图像（透射电镜及扫描电镜图像）；⑤细胞培养标本；⑥细胞和分子细胞遗传学检测结果。
（二）大体照相
大体照相是应用普通民用照相机，包括光学相机和数码相机，进行拍摄，对象包括患者体表病变、大体标本的外观、动物实验标本对照等实物。
1.患者体表病变照相体表病变拍摄需征得患者本人或患方有关人员同意，应遮盖患者的面容和隐私部位。病变应选择典型处，最好在自然光下，光线必须充足，尤其在用数码相机拍摄时。
2.大体标本照相在标本下面铺垫与标本颜色反差鲜明、平整的背景，并需置放标尺、病理编号和其他相关标记物，必要时添加箭头等符号标志指示重点部位。有条件时最好用专用的拍摄装置，相机固定在支架上，选用较慢的快门速度，以增加景深，确保拍摄图像清晰。如没有专用拍摄装置，应在光线充足的地方，用较快的快门速度拍摄。大体标本摄影应包括局部肉眼病变特征（近景）及其与毗邻结构的解剖关系（全景），突出重要病变，兼顾显示全貌。
（三）显微照相
1.光学显微图像照相是应用专用显微照相机拍摄显微图像，光学显微镜物镜的放大倍数分别为4×、10×、20×、40×，油镜为100×，照相接口有一3.3×的凸透镜。
2.照相用显微镜性能要求照相用显微镜必须有摄影目镜筒，即所谓三目显微镜，配置专用的照相机与显微镜接口，即“T”形接口，具有对不同光照条件进行光路调节的调节杆，物镜具有分辨率良好平场消色差物镜，聚光镜具有孔径光阑和调节光轴中心的机构，有视场光阑，可调高亮度光源，稳定的电源，并具有插入滤色镜的槽口。
3.显微照相机显微照相机一般是专用的，通过专用的“T”形接口与显微镜连接。显微照相机分手动、半自动、全自动三种，其主要区别在于拍摄过程中测光、曝光的自动化程度。目前，比较先进的显微照相机具有自动输片、自动测光校正曝光量、自动识别胶卷特征等功能。近年来，显微照相越来越多地使用数码相机。用于显微照相的数码相机有两类：一类是专用数码相机，通过专用“T”形接口与显微镜连接，并有自动测光、自动白平衡等功能，但价格昂贵；另一类是普通数码相机，通过显微镜目镜进行拍摄，这种数码相机必须是内调焦，即调焦时镜头没有前后移动。
4.显微摄影要点显微镜放置在稳固的桌面，显微照相机安装稳定，防止抖动，室内光线宜暗些以避免散射光进入目镜。普通透射光拍摄宜用感光度ASA 为100的彩色或黑白底片，倒置显微镜和荧光显微镜拍摄宜用感光度ASA 为400的彩色或黑白底片。视场光阑收缩到取景框边缘外。孔径光阑调到物镜孔径数值的60％～80％，例如孔径为0.25的10×物镜，聚光镜上光阑应调到0.25×（60％～80％）＝0.15～0.2。
拍摄过程：将视野调至有盖玻片的空白区进行测光，将显微镜上的拉伸杆调至测光位，调节视场亮度（日光型底片的色温点为5600K左右，灯光型底片的色温点定为3200K 左右）和滤色片（使用日光型底片时用雷登80系列）来调节色温，然后将拍摄视野与照明合轴，再将聚光镜调中，使光线同时调到观察目镜和取景目镜的视野之中，调节和校准取景目镜于标准状态，旋转调焦镜镜筒上的圆环，使取景框中央的双十字线达到最清晰，再调整取景目镜，并转动微调旋钮，同时使拍摄图像与取景框中的双十字线像达到最清晰，自动照相机此时即可拍摄，手动照相机此时需再测光，得曝光时间，调节镜头上的快门速度后拍摄。
暗视野、荧光和偏振光摄影时，拉动调节杆至最外处，将光线100％调到照相目镜的视野之中，用调焦镜观察视野中的标本图像，进行摄影。如图像分布不均匀，应将曝光增减旋钮调于0.25～4。
用黑白底片摄影时，必须按下列对应关系选择滤色片以提高图像反差和清晰度：
标本颜色红橙黄绿深蓝
滤色镜蓝、绿蓝、绿蓝红、蓝深绿、橙拍摄过程中应随时记录图像的拍摄日期、底片编号、切片编号、放大倍数、拍摄内容、摄影条件和备注等。拍摄完成后，如果暗盒内还有剩余底片，应在照相机上放置标记，防止其他人拍摄时误将暗盒打开，将已拍摄好的底片曝光，如果底片已全部用完，应及时将底片退回底片暗盒内，并及时冲洗。
（四）文字、图像资料、负片的翻拍
文字、图像翻拍应使用翻拍机进行摄影，才能保证翻拍的质量。在翻拍相机的两侧一般至少安装2～4盏100W 灯光，与照明直线呈45°角，以使光线均匀，拍摄物保存平整。拍摄条件可用测光表来确定。
X 线片、CT 片、核磁共振片等负片的翻拍需要有观片灯，相机固定在三角架上拍摄。用数码相机翻拍负片效果也相当不错。
（五）电子显微镜摄影
1.透射电镜摄影选择视野，确定放大倍数，检查电镜工作状态，确认样本无漂移现象，调节好灯丝像，消正像散，调整物镜光阑：样品反差较强时，使用较大的物镜光阑孔，直至反差适中为止；反差小时，宜用较小的光阑孔。样本聚焦在低倍电镜（＜1500倍）图像时，可采用摇摆聚焦法用肉眼定位；样品聚焦在高倍电镜（＞1500倍）图像时，除用肉眼观察定位外，还需采用系列拍照法：确定焦点后，用细调钮聚焦，增加物镜电流，每调动一级最小钮拍摄一张底片，总计拍摄4～5张，从中选择最佳底片。放平荧光屏，传送底片使之进入摄影位置。调定曝光亮度和速度，然后启动快门进行曝光；曝光结束后，将底片送入储存盒内。将底片全部摄影的储存盒取出，进行暗室冲洗等后期处理。用于透射电镜摄影的底片一般为色盲片（对红光不感光），曝光时间自动设置，宜适当降低亮度，延长曝光时间。
2.扫描电镜摄影选择视野，确定放大倍数，检查电镜工作状态。
（1）加速电压强度的选择：取决于样品的性质、图像反差和放大倍率。高倍观察时一般需要较高的加速电压，低倍观察时需要较低的加速电压。
（2）聚光镜电流的选择：在保证图像亮度和反差要求前提下，尽可能加大聚光镜电流，以提高照片分辨力，加大景深。
（3）物镜光栏孔的选择：对于表面结构高低差异大的样本可用较小的光阑孔，以获较大景深；低倍镜下观察时，可选用较大的光阑孔，以增加视野内的信号强度。选择摄影扫描速度。确定曝光时间。在扫描电镜照相机处于光圈F8或F11情况下，照片的曝光时间在50～100秒。
（4）图像的聚焦程度：主要依靠操作人员的肉眼观察。拍摄较低放大倍数（＜1000倍）的图像，以调节粗聚焦钮为主；拍摄较高放大倍数（＞1000倍）的图像，应先调节粗聚焦钮，再调节细聚焦钮。
（5）图像消像散：①先调节X 轴方向旋钮，消除X 轴方向的像散；②再调节Y 轴方向旋钮，消除Y 轴方向的像散；③最后再调节细聚焦钮，直到图像最清晰为止。调节高度和反差：扫描电镜一般装有亮度和反差自动调节按钮，按动该钮即可得到反差适当的图像。将照相机中的底片调至摄影位置，按动面板上的摄影快门钮，荧光屏上便由上而下自动扫描图像；扫描结束后，即完成一幅照片拍摄。
底片选择：扫描电镜装有120或135照相机，故一般选择感光速度为ASA100的120或135胶卷，装有Polaroid 后背相机的扫描电镜，可进行一次成像，但没有底片。
拍摄过程中应及时记录图像的拍摄日期、底片编号、样本编号、放大倍数、内容、拍摄条件和备注等。
（六）暗室技术
1.暗室技术①普通摄影、显微镜摄影和电镜摄影底片的冲洗及其照片的洗印和放大；②幻灯片的制作等。
2.摄影底片的冲洗操作程序①于完全黑暗中取出全色底片（色盲片或电镜底片可在红灯下取出）；②将底片卷入螺旋形的槽内或显影架上；③清水湿润2分钟；④显影3～12分钟（20℃）；⑤定影10～20分钟（20℃）；⑥水洗30分钟；⑦晾干底片；⑧分类装入底片袋内，并做好记录。
3试剂配制
（1）显影液配制：有多种配方，组成成分大同小异。下列的D－11配方兼用于冲洗底片及照片的洗印和放大显影。显影液配方：
水（50℃）500ml米吐尔1.0g
无水亚硫酸钠75.0g对苯二酚9.0g
无水碳酸钠250g溴化钾50g
加水至1000ml。
冲洗电镜底片、色盲片和制作幻灯片、显影照片等，需要极强反差，可用以上配方的原液显影。普通摄影用的全色底片对反差要求不高，可将原液用清水稀释成1∶2～1∶4的工作液。
（2）定影液配制定影液配方：
水750ml28％醋酸48ml
加水至1000ml。
定影液配方：较常用下列F5酸性坚膜定影液。
水（50℃）600ml硫代硫酸钠240g
无水亚硫酸钠15g28％醋酸48ml
硼砂（结晶）7.5g硫酸铝钾15g
加水至1000ml。
4.照片的冲印和放大病理科内冲印和放大照片一般使用黑白放大相纸。这类相纸根据反差分为特软性、软性、中性、硬性和特硬性等5种，即0、1、2、3、4号相纸。根据底片的厚度选择不同的相纸，底片反差较大者用2号或3号相纸，反差较小的用4号、5号相纸。
（1）冲印：在印相箱中操作（一般装有自动定时曝光控制器），主要用于制作透射电镜摄影的照片。已经曝光的相纸进入冲洗操作程序（同底片的冲洗程序）。
（2）放大：按一定比例放大底片，在专用的放大机上进行，适用于照片、幻灯片的制作。
操作程序：①放大镜头焦距的选择，参见表81。②装入底片：将底片的乳剂面向下，目测聚焦，使放大的图像结构清晰。③根据底片厚度选择相纸。④确定镜头光圈和曝光时间：对于正常反差的底片，将镜头光圈缩小到f／5.6～f／8之间，曝光时间控制在8～20秒为宜。⑤将曝光后放大纸进入显影、定影程序中。
底片规格135120120120120负片负片负片（16张）（12张）（10张）（9张）底片尺寸24×3645×6060×5060×7060×9080×10590×120108×125镜头焦距507575～8080～9090～105135150175（七）数码照相技术数码相机的应用方便、快捷，提高了工作效率。数码相机与传统相机一样，可以满足病理照相的多种需要，包括大体拍摄、显微拍摄、文字图表翻拍、X 线片翻拍等，而且，它有传统照相机无法比拟的一些特点，如可以用于各种需要、方便的后期处理、传输、储存等。
尽管数码照相机拍摄比较简单，但要照好一张数码照片却并不容易，特别是显微照片，因此，对数码相机一些重要参数必须有深入的了解，包括CCD 分辨率、镜头的光学质量、色深度、图像压缩率、存储卡、液晶取景器、变焦功能、最大闪光距离及最小拍摄距离（前者越大越好，后者越小越好）、快门速度范围、光圈大小范围、曝光补偿及自动平衡功能、文件格式、拍摄处理时间等。
