Dane氏颗粒表面由一种蛋白质包裹，被称作乙肝病毒表面抗原（HBsAg）。HBsAg具有较强的免疫原性，可用来制备疫苗。研究发现，HBsAg含有三种蛋白成分，分别由三种不同基因编码：①小蛋白（S蛋白）：为S基因编码的是由226个氨基酸残基组成的多肽，是HBsAg和HBV包膜的主要成分，也是HBV的主要蛋白；②中蛋白（M蛋白）：由S蛋白和前S2基因编码的55个氨基酸残基多肽（前S2蛋白）组成，它具有一个多聚人血清白蛋白（pHSA）受体位点；③大蛋白（L蛋白）：为M蛋白和前S1基因编码的108~109个氨基酸残基多肽（前S1蛋白）组成。
11.2.2.2表达系统
在弄清HBsAg的基因后，起初将S基因在大肠杆菌中表达和提取蛋白质，但表达产量低，发酵液中浓度仅为20±5μg/L，而且不形成颗粒、无糖基化，产品的免疫原性差，后转向酵母及中国仓鼠细胞（CHO）表达系统。国产基因工程乙肝疫苗主要有来自酵母表达系统和CHO细胞表达系统的两种疫苗，其中以基因工程酿酒酵母乙肝疫苗占主要地位。
（1）酵母表达系统
目前，国内生产的基因工程乙肝疫苗（HBsAg）是由S基因编码。基因构建的过程为使用内切酶将乙肝病毒的S基因切出，前面加上甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）1基因作为启动子，后面加ADH‐1基因作为终止子形成一个基因盒与pBS322质粒重组，该质粒上有细菌及酵母菌两者的DNA复制起点（即为穿梭质粒），它可以通过转化进入大肠杆菌或酵母菌，并在其中复制和表达。当上述表达载体进入酵母菌后，在发酵罐内酵母细胞达到高密度，并产生大量与天然物类似的病毒蛋白，大约占酵母总蛋白的1％~2％。重组蛋白可形成与乙肝病人体内免疫原性聚集体样性质的蛋白质聚体。
重组酵母乙肝疫苗的制备是从母种库的建立开始的。将重组酵母细胞进行1~2次单细胞克隆。挑选抗原表达水平高、且在发酵时抗原表达稳定的克隆。扩增选出的克隆细胞，分装到多个小瓶中（如25~100个），于—70℃以下冻存。这些小瓶称为母种库。接着用1瓶或数瓶母种进行扩增，并分装到100~500个小瓶中，同样于—70℃以下冻存。这些小瓶称之为生产菌种库。用生产菌种进行扩大培养，逐步放大到发酵罐。所有生产用菌种都来自同一菌种库。如一批生产菌种库用尽，可从母种库中取出另一批生产菌种库。这种菌种系统制备方法可保证每个生产批基因的均一性。
将生产菌种库小瓶中的菌液按下列程序进行培养，先接种入琼脂平板或小摇瓶，然后转移到大摇瓶、种子罐，最后到发酵罐。
培养基的组分、发酵温度、pH、溶氧浓度对重组酵母的表达都有影响。培养基可以是化学合成、半化学合成或复合培养基。在碳源中降低葡萄糖浓度、补充甘油和蔗糖能明显地改善比活值和HBsAg的相对浓度。可用分批补料或连续补料以保证最优生长和维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡。
发酵前期、中期和后期的温度分别控制在27℃、33℃和25℃；发酵从pH4.5开始，逐步上升到pH6；维持溶氧浓度在最适水平（70％饱和度），都可以提高重组质粒的稳定性和HBsAg的产量。此外，应在发酵液中添加诱导剂以诱导可调节启动子的表达。HBsAg的表达量一般多于50μg/ml，但不能分泌到细胞外，必须将细胞破碎才能得到HBsAg。
收集大规模培养的酵母细胞，破碎细胞，经硅胶吸附和疏水层析两步纯化，凝胶过滤，用福尔马林灭活和Al（OH）3吸附，即可制成乙肝疫苗。
用酵母表达HBsAg，产量高，生产工艺自动化，质量控制更严格；HBsAg颗粒大小与血源性乙肝疫苗一样，均为22nm球形颗粒。它与血源性乙肝疫苗具有同样的效力和保护效果，但不含任何血清成分，故更安全，更易为人们所接受。
（2）中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表达系统CHO（中国仓鼠卵巢细胞）细胞缺失二氢叶酸还原酶（DHFR），将编码乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的基因插入含有DHFR的表达载体，转染CHO细胞后，通过甲氨蝶呤（MTX）培养筛选可克隆出表达HBsAg的重组CHO细胞。CHO细胞属哺乳动物细胞类，它是基因工程表达系统中最高等的宿生细胞，其表达出的HBsAg大小和密度都与从人血中获得的HBsAg更类似，具有较强的免疫原性。而且具有抗原纯化简单等优点，适用于大规模工业化连续生产。
细胞先用含10％小牛血清的Eagle培养基培养，长成单层后转入含5％小牛血清的同种培养液，收集培养液上清，经细胞澄清、硫酸铵沉淀、CsCl密度梯度离心获得纯度大于95％的HBsAg。除菌过滤后，经吸附剂吸附等步骤，即可制成含有S蛋白的CHO细胞疫苗。
近几年，CHO细胞生产乙肝疫苗还不太完善，曾因在细胞培养过程中不规范使用抗生素、乙肝抗原收获次数没有明确规定、无法控制细胞代次、原液和成品中没有内毒素限定指标等，在2007年4月一度被暂停批签发。
【知识拓展】
乙肝疫苗的生产
自1981年起，国际上乙肝疫苗生产供应已经商品化，当时生产的是血源性乙肝疫苗。
血源性乙肝疫苗是一种不同于其他传统生物制品的特殊免疫制剂，是从乙型肝炎病毒携带者血液中分离HBsAg制备的，在制备疫苗时，除采用能分离HBsAg的纯化技术和能灭活已知病毒的灭活步骤外，还需要系列化的综合性安全和效力检定程序，以控制疫苗质量。由于制备乙肝疫苗的原材料来自人血，且制造检定程序复杂，不可能提供足量的疫苗施行普遍接种。
目前使用的多为基因工程乙肝疫苗，血源性疫苗已基本淘汰（原因是有引起血源性疾病的嫌疑和浪费大量的血浆）。基因工程乙肝疫苗可以用于预防所有已知亚型的乙肝病毒感染。
11.3其他新型疫苗
除了前面介绍的传统疫苗、基因工程疫苗外，近年来也出现了一些其他新型疫苗，如合成肽疫苗、抗独特型疫苗、遗传重组疫苗及微胶囊疫苗等。
11.3.1合成肽疫苗
按照病原微生物保护性抗原决定簇的氨基酸序列，人工合成含有保护性抗原决定簇的短肽，该多肽制成的疫苗，能够诱发机体产生免疫保护，称为合成肽疫苗。使用化学方法合成研制这类疫苗的前提是对目的蛋白一级和高级结构进行分析，预测该蛋白的抗原表位，并通过筛选确定有保护性抗原作用的肽段。该疫苗稳定、安全，且不需低温保存，可制成多价苗，但工艺复杂，免疫原性较差，故尚未推广。
11.3.2抗独特型疫苗
每一种抗体分子与抗原结合的高变区有其独特结构称为独特型。抗体可变区既可表现抗体的活性，与特定抗原表位相结合，同时又有抗原的特性，能刺激机体产生针对该独特型抗原决定簇的抗体（抗抗体），即抗独特型抗体。抗独特型抗体在结构上与刺激机体的抗原相似，因此利用抗独特型抗体代替抗原免疫动物可激发机体产生对相应病原体的免疫力。利用抗独特型抗体制备的疫苗称为抗独特型疫苗。
11.3.3遗传重组疫苗
遗传重组疫苗指使用经遗传重组方法获得的重组微生物制成的疫苗。
通常是将人体无致病性的弱毒株与强毒株（野生株）混合感染，弱毒株与强毒株间发生基因组片段交换造成重组，然后采用特异方法筛选出对人体不致病的但又含有强毒株强免疫原性基因片段的重组毒株。
11.3.4微胶囊疫苗
微胶囊疫苗也称可控缓释疫苗，指使用微胶囊技术将特定抗原包裹后制成的疫苗。微胶囊是由丙交酯和乙交酯的共聚物制成，可干燥成粉末状颗粒，不需稳定剂和冷链。用微胶囊包裹的疫苗，由于两种酯类的比例不同，颗粒大小和厚薄不同，注入机体后可在不同时间有节奏地释放抗原，释放时间持续数月，高抗体水平可维持两年。因此，微胶囊疫苗是改进的疫苗新剂型，可起到初次接种和加强接种的作用，从而达到简化免疫程序和提高免疫效果的目的。
【合作讨论】
课前讨论
1.举例说明怎样控制传染病？
2.你知道的疫苗有哪些？免疫过的有哪些？介绍它们的作用。
3.疫苗在人类健康方面发挥着怎样的作用？
4.巴斯德在疫苗发展史上，做出了哪些杰出贡献？
课后讨论
1.人用疫苗研究面临的挑战。
2.介绍一下艾滋病疫苗的研发现状。
3.你认为应该怎样突破目前艾滋病研发的困境？
4.寄生虫疫苗研究生产现状如何？
5.举例说明细菌灭活苗的制备过程。
6.请介绍一下基因治疗与基因疫苗。
7.酶水解的多肽能否预防非典？
【复习思考题】
1.病毒类疫苗制备过程中，病毒的扩增方法有哪些？
2.画出类毒素类疫苗的一般制备工艺流程，并结合具体的生产实例对该工艺流程进行详细的说明。
3.画出病毒类疫苗的一般制备工艺流程，并结合具体的生产实例对该工艺流程进行详细的说明。
4.画出细菌类疫苗的一般制备工艺流程，并结合具体的生产实例对该工艺流程进行详细的说明。
5.请列举鸡胚接种的方法。
6.简述灭活苗与弱毒苗的异同点。
7.请解释疫苗、亚单位苗、类毒素、佐剂、灭活、基因缺失苗等术语。
