一、目的要求
1.学习并掌握细菌与真菌分离单菌落的方法。
2.了解不同细菌分离纯化方法的不同。
二、技能目标
1.能够用分区划线法或者连续划线法分离菌种。
2.能够用稀释分离法进行菌种的分离。
三、基本原理
微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离。在保藏菌种时不慎污染时也须予以分离。分离纯化即将待分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板、稀释平板混合或平板划线等技术完成。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。
四、试剂和器材
培养基、接种环、酒精灯、无菌培养皿、涂布器、恒温培养箱、无菌移液管、消毒棉球等。
五、操作步骤
（一）细菌的分离培养法
分离培养是细菌学检验的基本技术之一。分离培养的目的，是将检查样品中的一定数量的细菌均匀地分散在琼脂平板上，或从被检材料中分离出某一种特定的细菌。
1.平板的制备
将融化的琼脂培养基，冷却至46℃～50℃。在酒精灯火焰旁，右手掌心握住三角瓶的底部，左手打开三角瓶棉塞，以左手的无名指和小指夹持瓶塞，灼烧瓶口。左手拿培养皿，用左手的大拇指将皿盖掀开一缝，至瓶口刚好伸入，向皿内注入培养基约15mL，迅速盖好皿盖。左手持培养皿稍加旋转摇动，使培养基均匀分布于整个培养皿底部，然后平置于桌面水平位置，待凝后即为平板。
2.平板涂布分离法
将菌液分离样品摇匀，将0.1mL菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置。右手拿无菌涂布器在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直方向来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂布器再涂布几次。
3.平板混合分离法
将菌液分离样品摇匀，用无菌移液管取1mL的菌液移至无菌培养皿中，然后将其融化，凉至50℃左右的培养基，在每个培养皿内各倒入约15mL，摇匀，凝固，制成平板。
4.平板划线分离法
将菌液分离样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，注意不要划破琼脂，不要划得太疏，不要过多重复划线，以免形成菌苔。划线完毕，关上皿盖，灼烧接种环，于皿底用标记笔标记被检材料名称及日期，倒转置恒温箱中培养。
（二）真菌的分离
应用细菌的平板分离法（划线、倾注），能容易而满意地得到真菌的纯培养，具体做法如下。
1.划线法
（1）取琼脂培养基融化，冷却至45℃，注入无菌平皿中，每皿15～20mL，做成平板待用。
（2）取要分离的材料（如孢子、麸曲、混杂的或污染的真菌培养物）少许，投入盛有无菌水的试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。
（3）将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述悬浮液，进行平板划线。
（4）划线完毕，置温箱中培养2～5d，钩取单个菌落的部分，制片检查。若只有一种菌生长，即得纯培养；如有杂菌，可取培养物少许制成悬液，再作划线分离，有时须反复多次，才得纯种。
2.点植法
在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝或一些孢子直接放在平板上作分离培养，即可获得该种真菌的纯培养。
3.稀释法
（1）取盛有无菌水的试管5支（每管9mL），分别标记1、2、3、4、5号。取样品（如食品等）1g，投入1号管内。如分离样品为真菌孢子或真菌曲种，则1号管盛无菌水10mL，加一接种环的样品，振摇，使悬浮均匀。
（2）用1mL灭菌吸管，按无菌操作要求，从1号管中吸取1mL悬浮液注入2号管中并摇匀之，同样由2号管取1mL至3号管，以此类推，直至5号管。
（3）用无菌吸管从5号试管、4号试管……依次各取1mL悬液，分别注入无菌培养皿中，再加入融化后冷却至50℃的琼脂培养基约15mL，轻轻在桌面上摇转，静置，使凝成平板，然后倒置温箱中培养，2～5d 后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。
附：细菌与真菌的分离纯化技术实训报告
实训名称：细菌与真菌的分离纯化技术
姓名学号
专业班级
实训地点实训日期
一、实训目的
二、实训原理
三、实训材料
四、实训步骤
五、实训结果及分析
观察记录结果：微生物的菌落特征。
六、问题与思考
1.在恒温培养箱中培养微生物时为何培养皿需要倒置？
2.稀释分离时，为何要将融化的培养基冷却到50℃左右时，才倒入装有菌液的培养皿内？
3.如何确定平板上某个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。
