1562年（嘉靖四十一年），历任内阁首辅20年的大学士严嵩被嘉靖皇帝罢免，他所引用的私人也不免相继倒台，其中包括胡宗宪和鄢懋卿。他们既被确认为坏人，海瑞在他们当权的时候敢于和他们作对，当然算得上特行卓识。为此，他的声望大增。1564年，海瑞升任户部主事。
户部是主管全国财政的机关，属于要害部门，不过正六品的主事一类的官员并没有什么事情可做。大政方针出自堂官尚书侍郎，行政技术上的细节则为吏员所操纵。主事一类的官，根本不必每日到部办公，只是日渐一日增积做官的资历。然而，海瑞非同一般。
当时，嘉靖皇帝御极已45年，不上朝却有27年，而且自从24年前发生宫婢谋杀事件，他就搬出乾清宫，住进西苑的万寿宫，沉迷于向神仙祈祷和寻取道家的秘术以期长生不老。皇帝住在宫中的别墅里，对国家政事并非荒惰不问。他除了不按祖宗成法与大臣们相见外，仍然是乾纲独断，有时甚至干涉到细端末节。这位皇帝之爱好虚荣与不能接受批评，举世无双。他只接近少数佞臣，听到的是虚假情况，待事情败坏了，便把原先信任的大臣正法处斩，以推御责任而平息舆论。这种做法使得廷臣但求自保而更加不去关心国家的利益。他明明为谀臣所蒙蔽，却仍然自命为尧舜。
1566年3月，海瑞经过慎重考虑后，向嘉靖皇帝递上了名为《治安疏》的著名奏疏。奏疏中指出：皇帝陛下是一位贪婪、自私、残忍、愚蠢的君主。举凡吏贪将弱、民不聊生、水旱靡时、盗贼滋炽，陛下都负有不可推卸的责任。陛下以尧舜之君自许，实际上“不及汉文帝远甚”。陛下天天与方术道士在一起，祈求长生不老，然而上天不会说话，长生不可求致，这些迷信只不过是左右奸人迎合陛下的悬思妄念，制造出的怪诞把戏。更为尖锐的是，奏疏中指出：“天下之人不直陛下久矣！”这句话的意思就是天下人很久以来就不认为皇帝是正确的了。他举例说，皇帝陛下的年号是嘉靖，但人们说“嘉靖者，言家家皆净而无财用也”。
批评虽然激烈尖锐，但谨守人臣的本分。奏疏中所要求于皇帝的只不过是幡然悔悟，放弃玄修，日视正朝，与廷臣一道尽心治理国家。如果能做到这一点，就能洗刷数十年君道之误，置身于尧舜等古代圣君贤主之上。而这一切做起来并不难，仅在“陛下一振作间而已”。陛下一振作，则百废俱举，百弊刬绝，唐虞三代之治可以粲然复兴。
然而，这份奏疏仍是史无前例的。以往对皇帝的批评，一般仅仅针对某项或几项政策，进行全盘否定者几乎没有，更没有对皇帝的性格和品行进行指责的。这份奏疏却不同，不但否定了当朝皇帝玄修二十几年来的所作所为，而且指出他连为人夫为人父的责任也没有尽到，其唐突之处，古今罕见。
嘉靖皇帝读了奏疏，震怒的情状自然可想而知。据说他当时手中紧攥着奏疏，在殿中急促地踱着步，嘴里喊叫道：“抓住这个人，别让他跑了！”旁边有个叫黄锦的宦官，为了平息皇上的怒气，跪下禀奏说：“万岁不必动怒。这个人向来就有痴名，听说他已自知忤逆万岁，必死无疑，所以他在上奏疏前就买好一口棺材，召集家人诀别，仆从已经吓得统统逃散。这样的人，是不会逃跑的。”
嘉靖皇帝听了，默然无声。随后将奏疏展开，一读再读。他没有将海瑞立即逮捕治罪，只是将奏疏扣下，不予批复。他的态度显得很矛盾。海瑞的奏疏中提出了那么多不可回避的问题，又提得那么直言不讳。这些问题早就存在，但是以前就是没有哪位廷臣敢于言及。因此，他将海瑞比作古代的忠臣比干。但有时他又觉得气恼、窘迫，骂海瑞是“畜物”。有时责打宫女，宫女就在背后偷偷地说：“他自己挨了海瑞的骂，拿咱们出气。”
当时嘉靖皇帝尽管年届花甲，却并未到衰朽的年龄，况且锦衣玉食的条件使帝王有可能比常人衰老得慢一些。但是，他长期沉迷于长生不老的梦想，服用道士炼造的丹药，造成慢性中毒，已是四肢麻木，行动迟缓，目光呆滞，力不从心。他甚至动了退位当太上皇的念头。他对大学士徐阶说：“海瑞这个畜物骂我，骂得对。但是朕老了，哪能还像早年那样每天都上朝。”徐阶当然说陛下春秋甚富，禅位的想法万万要不得。他又气囔囔地说：“朕自己不小心，致使遭受疾病的困顿。朕要是能出宫上朝，哪能挨这个畜物的骂。”越想心里越气恼，于是亲手在海瑞的奏疏上批写道：“詈主毁君，送锦衣狱究问。”时间是海瑞上疏后的一个月。
不久，海瑞被移送刑部定罪。刑部议决，依据儿子诅咒父亲的律例，判处他绞刑。嘉靖皇帝登基四十多年来，批准过许多人的死刑，这时候却未在刑部狱案上作任何批示。这样，海瑞在狱中一呆就是10个月。
有一天，狱中忽然设酒肴相待，海瑞以为这是临死前的最后一餐，他神色不变，饮食如常。提牢主事（相当于现代的监狱长）悄悄告诉他，皇帝业已升遐，新君不日即位，你老先生乃是忠臣，一定会得到重用。海瑞听罢，立刻放声号哭，号哭之余，继以呕吐。
1567年初，隆庆皇帝登基，海瑞被释出狱。
