诺贝尔在他生命的最后几年，曾先后立下三份内容非常相似的遗嘱。第一份立于1889年；第二份立于1893年；第三份则立于1895年，存放在斯德哥尔摩的一家银行，也就是要以此为准。
1889年3月，五十六岁的诺贝尔在给一位住在斯德哥尔摩的熟人写的信中说：
“请你费心请一位瑞典律师，给我准备一份遗嘱的适当格式。我头发已灰白，身体虚弱，我必须避免死后的纠纷。
我早应该准备了，只是我忙着许多其他的事。”
诺贝尔只是在索要一个样本，在拟定格式后起草各项条款。然而寄给他的样本，措辞过于空洞，不合实用。本来诺贝尔经过多次诉讼案件的教训，对律师已不信任，指责他们是“渺小的寄生虫”，现在更是对他们失去信心。于是决定由自己拟定。第一份遗书看来比较简单，也并未拟完，内容中主要强调了分配一笔基金给斯德哥尔摩大学。
第二份遗书写于巴黎，时间是1893年3月14日，见证人是汤劳斯顿、诺登费尔特、尼尔生和埃伦伯格。这份遗嘱未指出确定款数，只是列出他财产的一定百分数分给各个人。
这些人是他的朋友和亲属，共有二十二人之多。他财产的百分之二十是分给他们的。此外他将一定比例的财产分给下列各社会团体和教育学术研究机构：巴黎的瑞典俱乐部、维也纳的奥地利和平朋友协会（为推进和平方案专用）、斯德哥尔摩大学（管理部门可斟酌支用）、斯德哥尔摩医院（罗琳娜斯卡研究所管理部门决定支用）。他还拨出一笔款项给罗琳娜医学研究院建立一项基金，遵照管理部门的决定，每三年将基金所得利息奖给生理学或医学领域内最重要和最新的发现或发明。诺贝尔特别指定将他财产的百分之十七分给上述各团体。遗嘱中接着写道：
“余下的财产全部赠予斯德哥尔摩科学院，建立基金，每年由科学院将利息奖给在知识和进步的广大范围内（除去生理学和医学）最重要和最新的发现或才智的成就。虽然我没有列出绝对条件，不过我的愿望是奖给这样一些人——他们不论在文字或行动上同一些人或政府坚持反对创建欧洲和平法院的偏见进行斗争取得成功。我希望按照我的遗嘱考虑奖给最应获得的人，不管是瑞典人或外国人，是男人或女人。”遗嘱又接着说：
“我想用一笔巨大款项扩建大城市的火葬场，希望斯德哥尔摩罗琳娜斯卡研究所愿意承担这件事，这是对社会健康和福利有关的重要事，应热心完成。”
显然这份遗嘱比后来的一份更有效，因为已指定各受托人。这份遗嘱和最后的遗嘱有一些差别。在这份遗嘱中没有指定挪威国会或瑞典学士院分配奖金。上列各机构所行使的权力概付与科学院，至于和平奖可以选定一机构。
这份遗嘱中没有提到文学奖，但这份遗嘱说到科学院不仅分配物理学和化学奖，还奖给“在知识和进步的广大范围内（除去生理学和医学）最重要和最新的发现或才智的成就”，这就是说科学院还有权力授奖给文学以及语言学、生物学、数学或其他方面做出成就的人。不十分明确的是诺贝尔想的每年只颁发一项奖（例如物理学），还是各科学的几项奖？前一种情况似乎有较大可能性，即一年颁发物理学奖，第二年颁发化学奖，如此类推。
这两份遗嘱还有一点差别是应该说到的。按照第二份遗嘱，和平奖是奖给为创造“和平法院”积极工作的人。而最后的遗嘱，受奖人是对国际间的友好、裁减或废除常备武装、创立和推进和平会议做出最有成就的工作的人。最后的遗嘱没有提到和平法院，努力创立和平法院的人要在这个法院被肯定有促进国际间友好的趋向后方能获奖。
1895年11月27日，诺贝尔在巴黎的瑞典俱乐部签署了他最后的遗嘱，见证人是陆军中尉埃伦伯、法官诺顿费尔特、工程师斯特雷伦纳特和瓦斯。这份遗嘱对1893年的遗嘱做了一些改动，但仍保留主要部分。这份用瑞典文写成并存放在斯德哥尔摩一家银行里的遗嘱，于1897年公之于众：
签名人阿尔弗雷德·诺贝尔，在经过慎重的考虑之后，就此宣布关于我身后可能留下的财产的最后遗嘱如下：
我所留下的全部可变换为现金的财产，将以下列方式予以处理：这份资本由我的执行者投资于安全的证券方面，并将构成一种基金；它的利息将每年以奖金的形式，分配给那些在前一年里曾赋予人类最大利益的人。上述利息将被平分为五份，其分配办法如下：一份给在物理学方面做出最重要发现或发明的人；一份给做出过最重要的化学发现或改进的人；一份给在生理学和医学领域做出过最重要发现的人；一份给在文学方面曾创作出有理想主义倾向的最杰出作品的人；一份给曾为促进国家之间的友好、为废除或裁减常备军队以及为创立和推进和平会议做出过最大或最好工作的人。物理学和化学奖金，将由瑞典自然科学院授予；生理学或医学奖金，由在斯德哥尔摩的罗琳娜医学院授予；文学奖金，由在斯德哥尔摩的科学院授予；和平战士奖金，由挪威议会选出的一个五人委员会来授予。我明确的愿望是，在颁发这些奖金的时候，对于受奖候选人的国籍丝毫不予考虑，不管他是不是斯堪的纳维亚人，只要他值得，就应该受奖。
他明确指定两名瑞典土木工程师拉格纳·索尔曼和鲁道夫·利列克维斯特作为执行人，他们同他自己一样是在国外工作的。只有二十六岁的索尔曼，已在巴黎、圣雷莫和博福尔斯作为他的雇员达三年之久；而对四十岁的利列克维斯特，他则只见过两次面。因为索尔曼被第一个指名，而且对这份遗嘱有着更直接的了解，因此他在落实这份遗嘱方面，显得更为积极。索尔曼说过，由于这两位执行人对法律事务感到不熟悉，他们指定当时在斯堪的纳维亚上诉法院当陪审推事的卡尔·林哈根作为瑞典的法律顾问。这对于最后实现阿尔弗雷德·诺贝尔遗嘱的基本思想，是非常幸运的一步。
林哈根采取气量宏大的态度来处理遗嘱引起的法律问题，而不仅仅局限于形式；他对贯彻执行遗嘱人的思想很感兴趣，并且积极与瑞典科学院等与这份遗嘱有关的瑞典国家当局进行巧妙接触和合作，因为他们是被指定作为奖金颁发机构的。他实际上成为经管这份财产的共同执行人。执行遗嘱的主要推动者，是拉格纳·索尔曼。
阿尔弗雷德·诺贝尔所积累的财富，即使以当代标准来计算也是很大的——总共有三千三百多万瑞典克朗（合二百多万英镑）。
这份遗嘱有几处要点写得不足和含糊，准确地解释与尽可能正确地落实它，是一项巨大的、复杂的和极其困难的任务。四海为家的阿尔弗雷德·诺贝尔的实际户籍，以及由此而来的法律谈判的法庭，都不清楚。遗嘱指明的遗产继承者，是一个尚不存在的基金会。大量的金钱，散布在有着差异很大的财产法的不同国家里。来自那些认为受到不公正待遇的亲属们的强烈反对，开始在各方面发生并且分成了若干集团。遗嘱中指明作为奖金颁发者的瑞典和挪威机构，在接受由于这笔捐献规定转移给它们的巨大的责任方面，也有两种意见，当时对于这项任务的范围和影响，还不可能预见得到。那真是一个由各种安排、观点、图谋与持久诉讼等构成的错综复杂的混合体，卷进去的则有几个国家的金融、科学和法律方面的专家，报界对所采取的每一个步骤发表的支持和反对的评论，也使得正在以建议者、劝告者和调解者身份进行勇敢战斗的执行人感到事情并不那么轻而易举。在解决这项巨大财产方面可以想像到会出现的一切困难中，他们没有一件能够躲得过去。
在1950年，只用瑞典文出版的一本题为《一项遗嘱》的书中，拉格纳·索尔曼对事件的过程做了充分和生动的说明。他写道：
“这项遗嘱只有一点是完全明确的，那就是指定利列克维斯特和我作为执行人，以及规定我们的任务。因此，最大限度地利用这一条款和设法保证我们的特权，就成为我们的义务。”阿尔弗雷德·诺贝尔几乎把他所有的巨额财产全部遗赠给人类，奖励那些在世界和平、科学和文学领域内做出杰出贡献的人们。这个史无前例的遗嘱震动了整个世界。此外，同样使全世界感到震惊的是：诺贝尔明确地提出，这笔奖金应该用来提高那杰出人物的威望，不论性别，不论国籍，不论来自哪个大陆，不论讲什么语言。当时民族主义情绪高涨，就连一贯对政治持冷淡态度的北欧国家也遭到波及；当时瑞典和挪威之间存在着争议，但诺贝尔却坚信挪威最有资格主持评定和平奖。
当然，设立和平奖最令人百思不得其解。当时广大公众对诺贝尔并不了解。在他去世之际，舆论界是这样描写他的：一位研制致命武器的大发明家和制造商，却把通过销售摧毁性武器所积聚的全部财产献给了建设美好世界和人类的和平事业。一般公众认为，诺贝尔的发明创造为大规模屠杀提供了方便，因而良心受到谴责，为了补过赎罪，他才做出了如此决定，甚至还有人提议拒绝接受这笔沾满鲜血的金钱。诺贝尔的遗嘱于1897年初在瑞典发表之后，最初不但没有得到瑞典公众的赞同和颂扬，反而遭到社会舆论的批评和谴责。当时瑞典社会舆论批评和谴责诺贝尔遗嘱的理由之一是，诺贝尔为什么没有把这笔巨额遗产捐给瑞典，而是实际上捐赠给了全世界。诺贝尔把奖励为和平事业做出杰出贡献的人的权利授予挪威议会，更触犯了瑞典人的民族自尊心。
挪威为了实现独立自主，进行了长期的、不屈不挠的斗争，正准备废黜国王，以割断与瑞典的最后联系。皇室大部分的权力已经移交给挪威议会。诺贝尔逝世的时候，挪威议会正在发起一场运动，反对挪威向军队提供经济援助。和平主义在道义上给民族主义斗争提供了强有力的支持。以国王为首的瑞典公众，认为此举无论是有意的还是无意的，都表明他支持挪威从他自己祖国的国土上分裂出去。此外，诺贝尔在遗嘱中明确地提出，斯堪的纳维亚人在获奖方面不具有任何优先权，为此他们更为恼火。
诺贝尔既然没有给瑞典任何资金和特权，为什么要瑞典承担这些额外工作，从而给瑞典人带来不能给他们任何利益的麻烦。瑞典那两所将负责评定各国科学家和作家的成就的学术机构，也准备拒绝接受这项光荣的使命。瑞典科学院和罗琳娜医学研究所尽管享有盛誉，实际上只是一种地方性的由知名学者组成的机构，要接受这项任务，无论在精神上还是在组织上都毫无准备。这项新的使命范围很广，任务很艰巨，很可能打乱他们的正常业务。就连瑞典国家本身也有可能由于奖金的分配问题陷入国际范围的争论，或者被认为有所偏袒而有损国家声誉。
当时瑞典社会舆论的这种批评和谴责倾向，在时任瑞典科学院院长的汉斯·福舍尔的不满情绪中得到集中反映。
福舍尔认为，诺贝尔的巨额遗产理应捐赠给瑞典科学院，以用来发展瑞典科学事业。不然的话，他将拒绝执行诺贝尔遗嘱中的委托，拒绝参加与诺贝尔物理学奖和化学奖评奖细则的研究和制定有关的一切会议。
总之，在诺贝尔遗嘱公布之初，瑞典的社会舆论的批评和谴责之声占了上风。
诺贝尔遗嘱披露之后，对这份遗嘱最不快和最不满的人，还不是一般的瑞典官员和民众，而是诺贝尔的亲属。阿尔弗雷德·诺贝尔两个哥哥的子女早就料到他会将一大笔财产遗赠给公共福利事业。但是，现在他们痛苦地发现，他们几乎得不到什么遗产，这远远超出了他们的预料。他们也知道，根据先前的一份遗嘱，都能分享到一大笔财产。尤其严重的是，在俄国的路德维希的子女这一支，势必会蒙受巨大的损失。这是由于诺贝尔在巴库石油企业的股份将兑换为现金，这个消息打乱了票证交易所股票买卖的局面。他的大宗股票在巴库油田起着决定性的作用，要么买下这批股票，否则诺贝尔家族就会失掉这个庞大企业的控制权，何去何从引起了巨大的关注。在不同国家几条战线上进行的关于这份遗嘱的诉论程序被拖延达几年之久，并且由于反对遗嘱的家庭方面所采取的广泛与激烈的措施而变得更加困难。然而以伊曼纽尔为代表的所谓俄国支系，也就是他哥哥路德维希的家族，站到了执行人的方面。经过激烈的持久讨论后，伊曼纽尔在1898年2月声明说，他希望尊重他已故的叔叔的愿望，因此，将不对这份遗嘱提出异议。这在解决如何执行遗嘱的问题上，是一个转折点和重要的因素；这项声明在诺贝尔基金会的建立方面，实际上起了决定性的作用。
他们达成了一项对亲属们做某些经济让步的协议，并且同意由政府在执行人提出建议的基础上，经过与奖金颁发单位和诺贝尔家族的代表协商，然后规定出关于落实这项遗嘱和管理这笔财产的条款。因此，遗嘱人既未规定也没有预见到一项有影响的常识，即瑞典政府仍拥有至高无上、宪法约束和受到尊重的地位。当然，这个政府在推荐和选择奖金获得者方面，却没有权势。
由于还有很多遗留问题需要解决，因此又过了两年，才将一切事情办妥。通过1900年6月29日的一项政府决定，诺贝尔基金会的章程和细则，以及由各瑞典机构授予奖金的特别规则，都被确立下来了。
