北方匈奴的威胁才刚刚得到缓解，刘秀还来不及缓一口气，南方武陵五溪地方的少数民族又发生叛乱，并且很快攻克了武陵郡政府所在地临沅。
叛乱无小事，刘秀自然高度重视，他急派武威将军刘尚前去征剿，但结果是孤军深入，全军覆没。这让刘秀很震惊，就在刘秀一筹莫展时，朝中闪出一将，大叫道：“臣愿带兵出征。”
这个毛遂自荐、请求出征的人便是伏波将军马援。
建武十一年（公元35年）夏天，刘秀任命马援为陇西郡郡守。马援一上任，便整顿兵马，派步骑三千人出征。先在临洮击败先零羌，斩首数百人，获马牛羊一万多头。守塞羌人八千多望风归降。
建武十三年（公元37年），武都参狼羌（羌族的一个分支）与塞外各部联合，杀死官吏，发动叛乱。马援率四千人前去征剿。部队行至氐道县境，发现羌人占据了山头。马援命令部队选择适宜地方驻扎，断绝了羌人的水源，控制了草地，以逸待劳，不许出战。
羌人水草乏绝，陷入困境，首领们带领几十万户逃往塞外，剩下的一万多人也全部投降。从此，陇右清静安宁。马援在陇西太守任上一共六年。由于他恩威并施，使得陇西兵戈渐稀，人们也逐渐过上了和平安定的生活。
建武十八年（公元42年）春，麊泠县（今属越南河内市）发生叛乱，征侧自立为王，公开与东汉朝廷决裂。刘秀任命马援为伏波将军前去平乱。马援在浪泊与叛军大战三百个回合，大破敌军，斩敌首数千级，降者万余人。第二年正月，平息了叛乱的马援被封为新息侯，食邑三千户。
后来北匈奴对汉朝不安分时，马援也多次出兵捍卫了汉朝的荣誉。
此时五溪地方的叛乱，武威将军刘尚全军覆没，危急关头，马援主动请求出击，再度显示了“关山度若飞”的英雄气概。
而刘秀见马援一心报国，抢着出征，为朝廷分忧，心里也十分高兴。但他看见马援满头白发，已六十有二的人了，不免犹豫起来，说了句这样的话：“廉颇老矣，尚能饭否？”
马援一听急了，脱口而出：“大丈夫须当马革裹尸而还，岂可老死于床笫之间。”
对话戛然而止，虽然只一问一答。但刘秀却被马援的爱国敬业精神彻底打动了，于是，当即任命马援为大军统帅，率领中郎将马武、耿舒、刘匡、孙永等，统军四万人，南下攻击武陵郡境内的五溪叛军。
马援的南征兵团抵达临乡（今湖南省常德市武陵区）时，五溪叛军正在全力进攻县城。马援来得正是时候。他不顾疲劳，马上发动了对五溪叛军的进攻。内外夹击，叛军猝不及防，自然是大败而归，并且还留下了三千头颅。
宜将剩勇追穷寇，接下来，马援决定乘胜追击，消灭五溪叛军主力。他马上来了个两步走：一是派人探明路径，二是亲自制定作战方案。
汉军抵达下隽（今湖南省沅陵县）时，何去何从，面临艰难选择。当时有两条路可以深入叛军的心脏地区。一条从充县（今湖南省常德市）出发，是条阳关大道。它的优点是沿途是宽敞的大路，安全系数大大提高，缺点是线路长，距离远，后勤补给难度增大。另一条从壶头山出发，是“独木桥”。它的优点是线路短，路途近，自带干粮便可以解决温饱问题，缺点是路险坡陡。明枪易躲，暗箭难防，走这条路机遇与风险并存。
然而，就是这两条道，却让马援和副将中郎将耿舒产生了严重的分歧。
耿舒是属于保守派的，做事向来以谨慎稳重著称，他主张选择走“阳关大道”，理由是：虽然是绕道而行，要走很多“弯路”，但这条道路平坦，可以避免被善于打“游击战”的叛军伏击。
马援是属于豪放派的，做事向来以雷厉风行著称，他主张选择走“独木桥”，理由是走充县虽然安全，但行军缓慢，时间与战线都会拖得很长；而且，大军势必会消耗更多的粮食，增加后勤的负担，走壶头山可以达到出奇制胜的效果。
按理由，在军事路线选择这样的关键时刻出现分歧很正常，坐在一起好好地商量研究，最终确定正确的行军路线才是当务之急。然而，马援和耿舒两人对自己的选择都抱着“坚定”的态度，谁也不让步。
没确定统一的行军路线，出兵的日期便一拖再拖。眼看再拖下去，便要贻误战机了。马援只好把行军的两项意见同时呈报朝廷来裁决。
刘秀看了书信后，批了这样一句话：将在外君命有所不受。你是主帅，你看着办吧。意思很明显，就是委婉地同意了马援的战略。
刘秀虽然批得委婉，但耿舒却感到委屈。不满归不满，耿舒还是尊重了上级的指示，于是，大军便开始走“独木桥”了。
接下来的过程正如耿舒所说的那样，汉军刚过壶头山，很快就陷入了五溪叛军布下的天罗地网之中。
进退无路，汉军陷入了绝境。屋漏偏逢连夜雨，正值炎热酷暑，不久，汉军中发生了瘟疫，很快在军中蔓延开来，病死的将士数不胜数。
对此，马援采取的措施是，一边派兵固守营寨，抵御叛军的进攻，一边在溪岸山壁上凿出一个个小洞来。士兵躲在洞里面，一来可以休养，二来可以隔离病人。
五溪叛军困住汉军后，渐渐加强了攻势。马援见形势十分危急，以身作则，带领士兵进行了艰苦的反击。
众将士拼死拼活时，副将中郎将耿舒却在干着另一项“技术活”——抱怨：是啊，我主张走阳关道，你却偏要上独木桥，现在知道独木桥的滋味了吧。抱怨之后，他开始诉苦。他马上写了一封信给自己的兄长好畤侯耿弇。信中分两层意思：一是述说了汉军现在的艰难处境，请求增兵；二是痛诉马援的一意孤行，请求调查。
耿舒的意思很明显，把“兵困”的责任全推到了马援的身上。
耿弇接到书信后，不敢怠慢，立即把情况向刘秀进行了汇报。
听说南征大军陷入了进退维谷之境，刘秀自然很失望。而此时刘秀的女婿梁松等人又落井下石。刘秀一怒之下，马上来了个双管齐下，一方面对马援进行了怒骂，另一方面撤销了马援的军事指挥权。刘秀马上派遣梁松为虎贲中郎将，充任监军官，去追查马援的责任，接收马援的军队。
马援很想胜利，也需要胜利，他很想凭借自己的力量挽狂澜于既倒。然而，接到刘秀的谴责和追查的圣旨，马援悲愤交加，当场吐血晕厥过去了。
马援年老体弱，再加连日征战，本来体力和精力就到了极限，此时怒火攻心，一倒下去就再也没有站起来。马援以这种悲情的方式结来了自己辉煌而又凄凉的一生。
梁松到时，马援已死。梁松旧恨难消，趁机诬陷马援。
接下的事很简单了，在梁松的策应下，一些早就看不惯马援的人开始活动了。是啊，马援活着的时候太风光了，总是在刘秀面前抢风头，弄得一些自认为是天才的人都变成了庸才。马援活着的时候他们不敢找马援算账，死了这笔账也该有个了结了。
这些视马援为眼中钉的人就趁机诬陷他。马援以前在南方打仗时，听说有一种叫薏苡的药，可以防止中瘴气，据说具有百毒不侵的功效。马援打了胜仗凯旋归来时，就顺便带了一车薏苡回来。
薏苡一颗一颗的，晶莹剔透，形状跟珍珠一模一样。于是，这些人就给刘秀打小报告说：马援贪污受贿，曾从南方弄来了一车珍珠。
刘秀看到这个小报告后，显然是急火攻心了，下诏撤掉了马援的侯位。
马援的家人见状，只好偷偷地把马援给埋葬了，据说是用马革裹着他的尸体，当真了却了他“马革裹尸”的愿望，一代名将就此长眠于地下。
当然，也有人为马援鸣冤，朱勃便是其中一个。
朱勃是扶风人，曾任云阳（今陕西省淳化县）县令，十二岁就能够流利地背诵《诗经》《书经》，被人称为神童。他常常去拜访马援的哥哥马况，见面时，朱勃态度沉静，言谈流畅，谈笑自如。
马援其时才开始接触书籍，面对朱勃，不由得自惭形秽，自愧不如，怅然若失。
哥哥马况看出了弟弟的自卑反应。于是，马况亲自给弟弟酌酒，勉励弟弟。朱勃不到二十岁，右扶风郡就试用他代理渭城县（今陕西省咸阳市）县令。可当马援晋封侯爵高位时，朱勃却依然在原地踏步，仍然是一个县令，一直没有升迁。马援发达以后，常常仗着马家对朱勃旧日的恩情，很有些瞧不起朱勃，甚至有时还欺侮他。可是朱勃越发谦恭，依然与马家保持亲近。
等到马援受到诬陷和迫害时，世态炎凉，亲友宾朋一个个都避之唯恐不及。他们对马家统统敬而远之，纷纷溜之大吉。而此时朱勃挺身而出，长跪于宫门，上书为马援申冤，说马援“以死勤事”，应当得到公平的待遇，词语恳切，令人垂泪。
此时，马援的侄儿马严和马援的夫人也先后六次向皇帝上书，申诉冤情，言辞凄切。最终，刘秀像是被突然点化了，这才命令厚葬马援。
史书上对马援的能力评价颇高，说他“谋如涌泉，势如转规；兵动有功，师进辄克”。就是说，智谋如泉水一样喷涌不绝，行动如圆规一样灵活迅速；用兵战无不胜，出师攻无不克。现代作战的沙盘作业就是他率兵讨伐隗嚣时发明的。后人有诗赞曰：
挽月雕弓猎猎旌，
横刀立马定边庭。
蒙遭诬陷心无悔，
一片忠心日月明。
