玛丽的继兄莫里勋爵反对她的选择，因为他担心这会影响到他在宫廷的势力。因此，他站到了伊丽莎白一边，开始祸害他的妹妹。他是个阴谋诡计大师。玛丽必须采取行动。她召集士兵，出兵征讨兄长。由于战争一直持续到10月份，莫里的兵力逐渐减少。然而这位继兄拒绝了任何和解方案，在面临失败的威胁时，逃往英国。女王的强硬给那些幸灾乐祸地旁观这场战争的贵族们留下了深刻印象，形势开始变得对她有利。可是玛丽没有利用这大好机会，反而在婚姻问题上迷失了自己。
事实上，玛丽已经厌倦了她易变而虚荣的丈夫亨利。突然，在爱丁堡的大街上，他不再是国王，而只是女王的丈夫。而且，玛丽不许他再上她的床。于是当11月份女王怀孕的消息公之于众时，人们议论纷纷。这时，一个在玛丽的宫廷里自觉地扮演着不起眼角色的男人走上前台：戴维·里奇奥，女王的秘书和最心腹的亲信。无人能绕开他直接与女王打交道，因此他是贵族们的眼中钉。据说他身材矮小，相貌丑陋，是个驼背，嗜好颜色缤纷的衣服和首饰。他是那个温暖玛丽被窝的人吗?人们越是议论里奇奥，他越是开始炫耀他在宫中的地位。这是个错误，它加速了他的厄运的到来。
詹姆斯·赫伯恩，第四代博思韦尔伯爵，忠诚地顺从于玛丽。
里奇奥的发迹之路非常短，他很快地直上青云。1561年，他作为萨伏伊使节的随从来到苏格兰宫廷，先是作宫廷乐师，接着成为玛丽的男仆，最后当上她的秘书。他声称女王在一切事情上都听从他的建议。玛丽忽略了禁止他说这种话。这真是一个可怕的疏忽，如同她很快不得不认识到的那样。因为贵族们正在策划一场谋反。达恩利也在其中下了注，出于投机心理——或者出于嫉妒。
1566年3月9日傍晚，圣十字架宫发生一起谋杀事件。这晚，玛丽邀请最亲密的朋友们共进晚宴，其中有她的秘书。饭后，人们在一起坐了会儿。突然，一扇通向一道直达达恩利房间的螺旋楼梯的小门打开，他走进房里，似乎想要和妻子讲话。在他身后，武装贵族们蜂涌而进。他们的首领叫道，一切都是根据国王的命令行动的，戴维·里奇奥在陛下的私人房间里停留太久了。里奇奥藏在玛丽的沙发后面，这些贵族们冲向这只沙发。他们还想杀死女王吗?后来玛丽重复了这一观点。他绝望地死命扯住玛丽的裙子，然后人们拖走了这个意大利人，并捅死了他，一共56刀。一个勤快的秘书的残酷结局，而且就在怀孕6个月的女王眼前。
从那一刻起，玛丽就被监视起来。第二天早晨，当最初的震惊消失后，她振作精神，开始秘密筹备逃跑计划。为此，她需要她软弱的丈夫。她懂得如何迷惑他。3月11日晚，这对夫妇逃走了。达恩利比他的妻子更害怕，骑着马在前面快跑。她由于怀着孩子，请求他骑慢点儿，他听而不闻。直到到达邓巴要塞，玛丽这才安顿下来。她给伊丽莎白女王写了一封信，详细叙述了谋杀她的秘书的整个过程，并把拥护者集中到自己身边。在流血谋杀案九天后，她率领8千人回到爱丁堡。
通过这些戏剧性的事件，玛丽得知了谁真正对她忠心耿耿：詹姆斯·赫伯恩，博思韦尔伯爵。在几年前，·当本身是新教教徒的他在反对新教联盟的战争中，站在天主教的玛丽·封·吉兹一边的时候，他不得不逃走。1565年9月，玛丽才把他从流亡途中召回。经历逃亡后，玛丽·斯图亚特把国王军队的指挥权移交给他。她看重他的另一标志是，如今在3月初的议会正式开幕式上，他手持君主的权杖。
发生谋杀案的3月9日晚间，博思韦尔也在圣十字宫。谋反者们相当肯定地也把他视为玛丽的心腹。他被女王房间里传来的嘈杂声音吓得明白过来，随后成功地逃了出去，以便安排营救女王的行动。他很快备好马匹，接应出逃的女王，并陪伴她来到邓巴要塞。从此以后，玛丽·斯图亚特在博思韦尔的陪伴下，感到了安全。
爱丁堡城堡
在谋杀案发生的几天后，玛丽的继兄莫里又出现了。他并没有直接参与流血事件，因为有证据表明他3月9日不在爱丁堡，但却是知情人。一点儿不了解这一点的玛丽一心只想为被杀的秘书报仇，于是原谅了莫里以前的背叛行为，重新仁慈地接纳了他。赫尔密特吉堡，詹姆斯·赫伯恩(博思韦尔伯爵)的猎宫，1566年10月，玛丽急急赶来探望负伤的博思韦尔。那时池已是她的情夫了吗?
三个月后，6月19日，她在爱丁堡要塞生下一子，王储詹姆斯。今日的游客会吃惊于女王居室的狭小，然而选择这种房间的原因很简单，空间越小越温暖。“苏格兰女王适才生下了王子，我却是一枝枯萎的树干，不能发出新芽”，伊丽莎白悲叹道，当她听到来自爱丁堡的消息时。但是她充当了孩子的教母。只是她没有亲自出席孩子的洗礼，作为补偿；她赠送了一只金洗礼盆，还提出了英格兰和苏格兰之间签订一项心平气和的协定的新建议。伊丽莎白要求玛丽批准1560年的条约，公开接受新教为苏格兰的国教，以及正式宣布在伊丽莎白生前，放弃对英国王位的要求。但在她死后，玛丽的继承人可以登上英国王位。这一妥协提议符合玛丽早先的几次声明，但她一反常态，罕见地顽固起来，拒不接受伊丽莎白的建议。她也可以正式承认新教，因为她容忍了它，没有采取任何针对新教教徒的镇压措施，而且从未试图重新引进天主教。也许仅仅因为英国人选择了一个糟糕的时机提出建议，尽管伊丽莎白没有能意识到这一点。玛丽在儿子诞生以后，变得无法交谈和不理智——现代人也许可以将之称为产后抑郁症。直到10月份，她才重新有了活力。
一幅当时的漫画：玛丽被画成当时象征
荡妇的女水妖。兔子是博思韦尔家族族徽的组成部分。
也许原因在于那个在她生命中的日益重要的男人：詹姆斯·博思韦尔，一个真正的男子汉。她让他担任军队指挥官，派往英格兰—苏格兰边境地区。他在那儿经常发生的小冲突中负了伤。10月8日，玛丽接到博斯韦尔正在他的城堡赫尔密特吉堡养伤的消息。当时她还在一次周游全国的访问途中，正停留在杰德伯勒。女王没有考虑很久，就一跃上马，飞快地驰向40公里外的疗伤地。这样做是出于强烈的爱国激情吗?还是按捺不住的担忧?难道女王与她的将军之间有暖昧关系的谣言是真的?如果真是这样，那么这两个人都对婚姻不忠，因为博思韦尔也是结了婚的。
铸有玛丽·斯图亚特和她第二任丈夫
亨利·迭恩利肖像的原版金币。
今天的赫尔米特吉堡是一处阴森森、冷冰冰的废墟，直插云天，几乎没有一丝光能射进室内。这座年久失修的建筑物庄严雄伟，但却毫不舒适，就算在那时也不适合作浪漫的幽会之地。此外，继兄和参谋莫里励爵还陪伴着玛丽。此次探访应是表现了她对将军所取得功绩的赞赏。同一天，玛丽又骑马40公里，返回杰德伯勒。第二天一早她就病了，显然太过劳累。这种精疲力尽引起她虚脱，把她带到死亡的边缘。一个月后，人们才又在首都见到她。她现在特别愿意住在自己的庄园克雷吉米勒尔宫里，它位于爱丁堡城门前。10月底，总处于医生照看之下的玛丽与自己的亲信在这儿见面，其中还有几位新教贵族：这强调了玛丽·斯图亚特在宗教问题上并不教条的态度。在一次开诚布公的谈话中，女王坦率地道出了她的婚姻的真相：她想彻底摆脱她的丈夫，她与他在一起觉得恶心和不安全。这些贵族领主们同意离婚吗?罗马会对这一步骤如何反应?“陛下”，据说威廉·梅特兰曾安慰她，。请放心，我们，您的贵族和议院里最重要的人，将会为您找到从他那儿解脱出来的办法”。这些忠心的人没有食言。
这时，亨利·达恩利在格拉斯哥的父母处，因为他病得很重。公开诊断书上写的是天花，实际上他得的是梅毒，正如后来对达恩利颅骨所作检查所确证的那样。现今他的颅骨仍然保存在伦敦的皇家外科医学院。让所有人惊讶的是，1567年1月，女王亲自前去探望他。为了像一个忠贞的妻子那样照顾他，她说服他回家，并陪他坐在轿子里进入首都。谁知道在玛丽的心中，同情甚或爱情战胜了所有的不满，苏醒了?几乎不可能。出于对他的反感——达恩利必须对此负全责——，玛丽宁愿让他呆在身边，以便控制他。达恩利似乎被他妻子的关心打动，非常得意，对她的爱深信不疑，以至于毫无防备地跟着她回到了爱丁堡。但他们已经达到一致，他先不能进宫，因为对小王储来说，传染危险太大。他被送到城墙附近的一处房里，名叫柯克欧菲尔德。玛丽也成了这儿的常客。2月9日傍晚，在她回宫参加为一个宫女的婚礼而举行的假面舞会以前，她还与他共进了一顿简单的晚餐。但这一个晚上，在柯克欧菲尔德的地窖里，却发生了不同寻常的事。人们拖来沉重的箱子，而据一位后来在城墙上站岗的哨兵所说，深夜时分，身着黑衣的博思韦尔也出现在这个舞台上。2月10日凌晨，一声巨大的爆炸惊醒了爱丁堡城。柯克欧菲尔德被炸坏了。花园里躺着一具身着睡衣的尸体，旁边是一把椅子和一根绳子。他是亨利·达恩利——玛丽再度成为寡妇。
尸体上没有任何由于爆炸引起的伤痕。后来人们推测道，达恩利被楼下嘈杂的声音闹醒，由于房屋大门被锁死，他沿着一条绳子从窗口滑到花园里的一把椅子上，他能站在上面翻过围墙。但他的逃跑被发现了，杀手们消无声息地向他掩来并扼死了他。玛丽·斯图亚特并不知道这一切。当她激动地给派驻巴黎的使节红衣主教比顿写信时，估计这次袭击大约是针对她本人的。因为每个人都知道，她那时正在探访她的丈夫，只是由于偶然因素，她那天晚上没有呆得更长。但在爱丁堡的大街小巷，人们相信大家都知道凶手是谁。博思韦尔是凶手，他们说，而女王是知道内情的。各处墙上贴着传单和漫画，揭露女王是个婊子，并毫不避讳地指出她可能是杀害丈夫的凶手。在死者家庭的压力下，将军出庭受审，但在一次短短的审讯过程后，即被宣布无罪。玛丽呢?她事前知道这场袭击吗?自那夜起，人们的看法就大相径庭。她是个同案犯，或者只是知情人，任由谋杀案发生?在回顾这件事时，不得不问上一句，撇开一切道德观念不谈，这是否是玛丽最聪明的一次决定。因为亨利·达恩利，这个毫无良心的阴谋家，一开始就是她道路上的障碍。
错误的决定
玛丽可以再次结婚了，而博思韦尔的野心太大，他想赢得女王及由此而来的王冠。1567年4月，当贵族们来到爱丁堡参加议会会议时，4月19日晚，他邀请其中几位去一家小酒馆喝酒，向他们透露了他的计划。他让他们写下书面保证，支持他追求玛丽，“在这种情况下，目前没有丈夫的女王陛下，感觉到有必要重新结婚，并且准备如此降贵纡尊，愿意把她的臣民中的一位选作丈夫，他出生于苏格兰，考虑到他对她一贯的忠诚与谦恭，以及他其余的优秀品格与功绩，女王陛下作出这一决定”。由于这个小酒店的名字叫艾斯利斯酒馆，这一协定叫作艾斯利斯协定，文件至今保存在苏格兰国家档案馆。玛丽·斯图亚特后来猜想这款协定是她的敌人的一个阴谋，他们想把她推向毁灭。
接下来几天发生的事件极具戏剧性。4月23日，女王看望完住在斯特林堡的独生子回城。这是玛丽·斯图亚特最后一次看见詹姆斯。在离爱丁堡几英里的地方，阿尔蒙德桥横跨河上，女王的旅队在此地被博思韦尔阻住。他抓住女王坐骑的缰绳，要求女王与他一起骑马离开，因为在爱丁堡城内潜伏着危险。玛丽顺从了他。博思韦尔把他带到自己的邓巴要塞。女王在这儿没有逃走的可能，而且也没有人试图解救她。据说，在第一个晚上，博思韦尔就对女王施展了魅力。直到九天后，这个忠心的随从才陪伴着他的陛下回到爱丁堡。不久后，他们举行了婚礼庆典，前来观礼的客人没有一位真正出身高贵或者有地位，而新娘又一次披上法国人视为寡妇所穿的白衣。英格兰女王再度被大大地激怒了。安斯利斯协定——苏格兰贵族们向詹姆斯·博思
韦尔伯爵保证，支持他追求玛丽·斯图亚特。
而玛丽·斯图亚特怎么说?“这一切的确非常少见，令人诧异，而且我们也知道，您并不希望它发生。但是既然它现在已经发生了，那么，我们必须让它得到最好的结果”，她在一封写给比顿的信中如此解释她的这一做法。她预感到这场仅在达恩利悲惨地死去三个月后就缔结的婚姻是个错误?或者她暗示她没有其他选择?这第三次婚姻是一次政治上的失败宣言：玛丽的新夫是一位新教教徒，刚刚离婚，而且是她的臣子。关于这场婚姻有许多不同的说法：第一种说，博思韦尔早就是玛丽的情人，在她经历纯政治性的第一次婚姻和对达恩利的失望后，年轻的女王第一次全身心地恋爱了。因此上演了一场“诱拐”的戏，这样玛丽可以在公共场合声明，博思韦尔强迫她这么干。一场恋爱悲剧，斯特凡·茨威格用精辟的语言这样描述它：“因为这种热情里蕴含着某种可怕的东西，类似这样的东西同时让女王既如此出众又如此可怖——种不可战胜的可怕的东西。女王一眼就看出，她的爱情选择是一种犯罪，而且毫无出路。从第一次拥抱中产生的清醒必定是骇人的，这是一个特里斯坦经历过的瞬间，因为她，中了爱水之毒的她，从心醉神迷中超脱出来”。另一种观点是，女王这样绝望，所以她任由博思韦尔对她为所欲为。最后还有人推想，博思韦尔在他的城堡强暴了女王，她尽可能不去惹恼他，而且为了自身的安全而依顺了他。“在他诱拐并违背她的意愿占有了她之后，女王不得不与他结婚”，梅尔维尔，少数陪同女王前往邓巴的人之一，在回忆录中写道。无论如何，在婚礼几天后，法国使节杜·克洛克向巴黎报道：。昨天，当她与博思韦尔伯爵单独呆在一个房间里时，她突然大叫起来，说人们也许应该给她带把刀子来，这样她就能自杀了。”
